APP下載

上海交大致遠榮譽計劃2019級博士生石欣發現基因編輯新切割方式

2019-10-08

    2019年10月1日,上海交通大學系統生物醫學研究院比較生物醫學中心吳強課題組在基因編輯領域又取得新進展,國際著名OA學術期刊《細胞發現》發表了題為“Cas9 has no exonuclease activity resulting in staggered cleavage with overhangs and predictable di- and tri-nucleotide CRISPR insertions without template donor”的最新研究成果。該研究發現了SpCas9新的切割方式,并首次提出SpCas9沒有外切酶活性。

    基因編輯在生物醫藥和生命信息等領域中一直扮演著重要的角色,傳統的基因編輯技術由于構造困難因此在一定程度上阻礙了它的發展,而CRISPR/Cas9技術的問世則很好的克服了這一缺點。CRISPR/Cas9系統是細菌和古生菌的一種天然免疫系統。當外源核酸入侵時,Cas9蛋白就會在RNA的介導下定向切割核酸,發揮免疫功能。經過改造后的第三代基因編輯工具CRISPR/Cas9因其簡單,高效,低廉等優點為廣大科研工作者所利用。但即便如此,人們對Cas9蛋白的切割機制和切割后的修復機制還知之甚少。

    在以往的研究中,以CRISPR/Cas9領域的權威杜德娜(Doudna)和夏龐蒂埃(Charpentier)為代表的科學家們普遍認為Cas9只能在PAM位點上游3堿基處切割DNA雙鏈產生平末端,并把在體外切割實驗中觀察到的長短不一的切割產物解釋為Cas9的核酸外切酶活性。但近年來隨著研究的深入,越來越多的證據表明Cas9蛋白存在切割產生粘性末端的活性。這一顛覆性成果由吳強課題組首先取得,相關文章于2018年8月正式發表在國際權威期刊Molecular Cell《分子細胞》上,該文章第一次明確提出Cas9存在在非互補鏈PAM位點上游4堿基處切割產生粘性末端的活性,顛覆了傳統的認知。

    雖然Cas9在PAM位點上游4堿基處切割產生粘性末端的活性已經得到了承認,但對于Cas9是否存在其他的切割活性仍然存在爭議。圍繞這一問題,吳強課題組致遠榮譽計劃2019級博士生石欣和博士后壽佳利用一對sgRNA對DNA片段進行編輯,并對重排接口進行了高通量測序分析。結果表明不僅單堿基的插入存在著規律,兩堿基甚至三堿基的插入也同樣存在著相似的規律且這種插入可以精準預測:它們由PAM位點上游-4,-5,-6位堿基所決定。這種規律性的兩堿基,三堿基的插入暗示SpCas9存在著PAM位點上游-5,-6位切割的活性,這種新的發現作為一種補充,不僅擴大了人們對于SpCas9切割活性的認知,還從另一側面驗證了Cas9的在PAM位點上游4堿基處切割的活性。至此,吳強課題組修改了現有的模型,并提出了新的切割連接模型。

    為了進一步直觀地驗證這種新的切割活性,石欣和壽佳還進行了體外切割實驗并對切割產物進行了高通量測序分析,結果表明對于非互補鏈,Cas9切割后產生了不同長度的突出末端的切割產物,即產生了一個堿基,兩個堿基,三個堿基的5’突出末端。而對于互補鏈,切割產物長度一致。這一體外實驗不僅更直觀地表明Cas9在非互補鏈PAM位點上游-4,-5,-6位的切割活性,還對互補鏈的切割只發生在PAM位點上游3堿基處進行了驗證。值得注意的是,該研究第一次在體外切割實驗中直觀地證實了Cas9的產生粘性末端的切割活性。

    總之,該研究首次證明了Cas9在非互補鏈PAM位點上游-5,-6的切割活性,并否定了此前認為的不同長度的切割產物是由于Cas9存在外切酶活性所致這一假設。不僅如此,該項研究還為精確可控的兩堿基、三堿基的基因編輯奠定了基礎,并為人類遺傳疾病的治療提供了潛在的方向。在基因編輯如火如荼的今天,使用單個sgRNA切割造成基因失活早就成為常態,但利用一對sgRNA對DNA大片段進行編輯,并將其用于基因組元件及染色質三維結構方面的研究還并未成熟。可以預見,該研究不僅在基礎研究領域發揮重大作用,同時還有望推動對精確基因編輯及細胞修復機制的進一步深入理解。

    吳強課題組長期致力于基因編輯技術的研究,尤其關注于DNA大片段編輯。在2015年,課題組博士李金環和壽佳就在《分子細胞生物學》雜志發表了關于DNA大片段編輯的一系列系統性的工作。通過一對sgRNA的使用,產生的兩組四個斷裂末端連接后會產生包括DNA片段刪除,反轉,重復,易位等重排結果。課題組開發的DNA大片段編輯技術不僅方便了基因組元件功能的研究,還為疾病模型的建立提供便利。同年,吳強課題組利用DNA大片段編輯技術研究了CTCF蛋白的結合位點的方向性與染色體高級結構之間的關系,通過對CTCF結合位點的反轉,結合計算生物學揭示了CTCF蛋白結合位點的方向性在染色質高級結構中的重要規律,相關結果發表在國際頂級期刊Cell《細胞》上。不僅如此,課題組還利用DNA大片段編輯技術對原鈣粘蛋白腦發育功能進行了研究,相關進展于2018年6月發表在eLife上。

    上海交通大學吳強為通訊作者,交大致遠榮譽計劃2019級博士生石欣和博士后壽佳為共同第一作者,石欣同學今年6月以優異成績畢業于南開大學,于九月正式到上海交大報到。該研究得到國家自然科學基金委員會和科技部的資助。

原文鏈接:https://www.nature.com/articles/s41421-019-0120-z

來源:上海交通大學 新聞學術網

關閉窗口
  • 中國科學院生物物理研究所
  • 中國科學院上海高等研究院
  • 華中科技大學
  • 二維碼
曾道人玄机图全年资料